Bolehkah stesen kerja manual PCR atau qPCR digunakan untuk PCR bersarang?
PCR bersarang adalah teknik yang kuat dalam biologi molekul yang meningkatkan kekhususan dan kepekaan penguatan PCR. Ia melibatkan dua pusingan tindak balas PCR, dengan primer yang digunakan dalam pusingan kedua penyepuhlindapan untuk urutan dalam produk pusingan pertama. Sebagai pembekal stesen kerja manual PCR atau qPCR, saya sering menerima pertanyaan mengenai kesesuaian stesen kerja kami untuk PCR bersarang. Dalam catatan blog ini, saya akan meneroka sama ada stesen kerja manual PCR atau qPCR boleh digunakan untuk PCR bersarang dan membincangkan pertimbangan dan kelebihan.
Memahami PCR bersarang
PCR bersarang adalah pengubahsuaian teknik PCR standard. Dalam PCR standard, sepasang primer tunggal digunakan untuk menguatkan serpihan DNA tertentu. Walau bagaimanapun, dalam PCR bersarang, dua set primer digunakan dalam dua tindak balas PCR berturut -turut. Set pertama primer menguatkan serpihan DNA yang lebih besar, dan set kedua primer, yang terletak di dalam amplicon pertama, menguatkan serpihan yang lebih kecil dan lebih spesifik. Proses langkah dua ini dengan ketara mengurangkan penguatan bukan khusus dan meningkatkan peluang untuk berjaya menguatkan DNA sasaran, terutamanya apabila sasarannya terdapat dalam kelimpahan yang rendah atau apabila terdapat latar belakang yang tinggi DNA sasaran yang tinggi.
Ciri -ciri stesen kerja manual PCR atau qPCR
Stesen kerja manual PCR atau qPCR direka untuk menyediakan persekitaran terkawal untuk melakukan reaksi PCR dan qPCR. Stesen kerja ini biasanya mempunyai ciri -ciri seperti bangku bersih untuk mencegah pencemaran, stesen pipet laras untuk dispensasi reagen yang tepat, dan blok terkawal suhu untuk berbasikal PCR.
Bangku bersih di stesen kerja manual dilengkapi dengan penapis HEPA yang menghilangkan zarah udara dan mikroorganisma, yang penting untuk PCR bersarang sebagai pencemaran boleh menyebabkan hasil yang positif - positif. Stesen pipet laras membolehkan pengukuran yang tepat dan pemindahan jumlah reagen kecil, yang penting untuk kedua -dua pusingan pertama dan kedua PCR bersarang. Blok terkawal suhu boleh mensimulasikan dengan tepat kitaran suhu yang berbeza yang diperlukan untuk PCR, termasuk denaturasi, penyepuhlindapan, dan lanjutan.
Menggunakan stesen kerja manual PCR atau qPCR untuk PCR bersarang
Ya, stesen kerja manual PCR atau qPCR boleh digunakan dengan berkesan untuk PCR bersarang. Inilah Caranya:
1. Penyediaan sampel
Persekitaran bersih yang disediakan oleh stesen kerja manual sangat sesuai untuk penyediaan sampel. Apabila bekerja dengan DNA sasaran yang rendah dalam PCR bersarang, sebarang pencemaran boleh mengganggu hasilnya. HEPA - bangku bersih yang ditapis memastikan bahawa sampel dilindungi daripada bahan cemar luaran semasa pengekstrakan dan persediaan awal reaksi PCR yang pertama.
Sebagai contoh, apabila mengekstrak DNA dari sampel klinikal, persekitaran bersih stesen kerja meminimumkan risiko memperkenalkan DNA alam sekitar atau bahan cemar lain. Stesen pipet laras membolehkan penambahan reagen yang tepat seperti buffer pengekstrakan DNA, enzim, dan primer, memastikan reaksi PCR yang pertama ditetapkan dengan betul.
2. PCR pertama - bulat
Blok suhu terkawal di stesen kerja manual boleh melaksanakan kitaran suhu yang diperlukan untuk PCR yang pertama. Langkah denaturasi, biasanya pada sekitar 94 - 98 ° C, langkah penyepuhlindapan (suhu bergantung pada urutan primer), dan langkah lanjutan pada 72 ° C dapat dikawal dengan tepat. Kawalan suhu yang tepat ini adalah penting untuk penguatan yang betul dari serpihan DNA yang lebih besar dalam PCR pusingan pertama.
Stesen pipet juga memainkan peranan penting dalam menambahkan jumlah templat DNA, primer, dNTP, dan polimerase yang sesuai untuk campuran tindak balas. Pipet yang tepat memastikan bahawa keadaan tindak balas adalah optimum untuk penguatan bulat pertama.
3. PCR kedua - pusingan
Selepas PCR yang pertama, produk ini digunakan sebagai templat untuk PCR pusingan kedua. Workstation manual membolehkan pengendalian yang teliti terhadap produk bulat pertama untuk mengelakkan pencemaran. Stesen pipet boleh memindahkan jumlah kecil produk pertama ke campuran reaksi kedua.
Blok terkawal suhu sekali lagi menyediakan kitaran suhu yang diperlukan untuk PCR pusingan kedua. Oleh kerana primer pusingan kedua bersarang dalam amplicon bulat pertama, suhu penyepuhlindapan mungkin berbeza, dan stesen kerja manual boleh diselaraskan dengan sewajarnya untuk memastikan penguatan spesifik serpihan DNA yang lebih kecil dan lebih spesifik.
Kelebihan menggunakan stesen kerja manual untuk PCR bersarang
1. Kos - Berkesan
Berbanding dengan stesen kerja automatik sepenuhnya, stesen kerja manual PCR atau qPCR pada umumnya lebih kos - berkesan. Bagi makmal dengan belanjawan terhad atau yang tidak memerlukan PCR bersarang tinggi, stesen kerja manual menyediakan penyelesaian praktikal. Ia membolehkan PCR bersarang berkualiti tinggi tanpa memerlukan pelaburan yang besar dalam peralatan automatik yang mahal.
2. Fleksibiliti
Stesen kerja manual menawarkan fleksibiliti yang lebih besar. Pengguna mempunyai kawalan penuh ke atas proses pipet, yang membolehkan pelarasan berdasarkan keperluan khusus protokol PCR bersarang. Sebagai contoh, jika sampel tertentu memerlukan kepekatan primer yang berbeza atau profil suhu yang diubahsuai, pengguna dengan mudah boleh membuat perubahan ini semasa persediaan reaksi.
3. Latihan dan kebiasaan
Banyak juruteknik makmal sudah biasa dengan teknik pipet manual. Menggunakan stesen kerja manual untuk PCR bersarang tidak memerlukan latihan yang luas pada sistem automatik yang kompleks. Kebiasaan ini boleh membawa kepada pelaksanaan protokol PCR bersarang yang lebih cekap dan tepat.
Pertimbangan
Walaupun stesen kerja manual PCR atau qPCR boleh digunakan untuk PCR bersarang, terdapat beberapa pertimbangan:
1. Kemahiran Pengendali
Ketepatan PCR bersarang menggunakan stesen kerja manual bergantung pada kemahiran pengendali. Pengendalian sampel yang tepat dan teliti adalah penting. Kemahiran pipet yang tidak mencukupi boleh menyebabkan jumlah reagen yang tidak tepat, yang boleh menjejaskan kecekapan dan kekhususan PCR bersarang.
2. Throughput
Stesen kerja manual mempunyai throughput yang lebih rendah berbanding dengan sistem automatik. Sekiranya makmal perlu melakukan sejumlah besar tindak balas PCR bersarang secara serentak, stesen kerja manual mungkin bukan pilihan yang paling berkesan.
Stesen kerja manual lain yang berkaitan
Sebagai tambahan kepada stesen kerja manual PCR atau qPCR, kami juga menawarkan jenis stesen kerja manual yang mungkin menarik. TheStesen kerja manual analisis seldireka untuk ujian berasaskan sel dan boleh digunakan bersempena dengan PCR bersarang ketika mengkaji ekspresi gen dalam sel. ThePRCXI PIPETTING WORKSTATIONMenyediakan keupayaan pipet maju dan boleh menjadi tambahan yang berharga kepada makmal yang melaksanakan PCR bersarang. TheStesen kerja manual ELISABoleh digunakan untuk analisis hiliran produk PCR bersarang, seperti mengesan kehadiran urutan DNA tertentu menggunakan kaedah berasaskan ELISA.
Kesimpulan
Kesimpulannya, stesen kerja manual PCR atau qPCR boleh digunakan dengan berkesan untuk PCR bersarang. Persekitaran yang bersih, keupayaan pipet yang tepat, dan kawalan suhu yang tepat menjadikannya sesuai untuk semua peringkat proses PCR bersarang, dari penyediaan sampel ke penguatan pusingan kedua. Kos - keberkesanan, fleksibiliti, dan kemudahan penggunaan stesen kerja manual adalah kelebihan yang signifikan, terutamanya untuk makmal yang lebih kecil atau mereka yang mempunyai keperluan penyelidikan tertentu.
Jika anda berminat untuk mempelajari lebih lanjut mengenai stesen kerja manual PCR atau QPCR kami atau mempunyai soalan mengenai penggunaannya untuk PCR bersarang, kami menggalakkan anda menghubungi kami untuk perbincangan terperinci dan perolehan yang berpotensi. Pasukan pakar kami bersedia membantu anda mencari penyelesaian terbaik untuk keperluan makmal anda.
Rujukan
- Dieffenbach, CW, & Dveksler, GS (1995). Primer PCR: Manual Makmal. Cold Spring Harbour Laboratory Press.
- Innis, MA, Gelfand, DH, Sninsky, JJ, & White, TJ (1990). Protokol PCR: Panduan untuk Kaedah dan Aplikasi. Akhbar Akademik.
- Saiki, RK, Gelfand, DH, Stoffel, S., Scharf, SJ, Higuchi, R., Horn, GT, Mullis, KB, & Erlich, HA (1988). Primer - Penguatan enzimatik DNA dengan polimerase DNA termostable. Sains, 239 (4839), 487 - 491.